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以副溶血弧菌生物膜基質為靶點，采用96孔板結晶紫染色法篩選出纖維素酶、脂肪酶、蛋白酶k為單酶，將單酶組合為復合酶，在單因素實驗的基礎上，采用響應面分析法優(yōu)化組合酶濃度。通過結晶紫染色、菌落計數(shù)、掃描電鏡等，評價組合酶對304不銹鋼上副溶血弧菌生物膜的抑制作用。響應面優(yōu)化得到的組合酶中纖維素酶濃度為1.00 mg/mL，脂肪酶濃度為1.10 mg/mL，蛋白酶k濃度為1.50μg/mL時生物膜抑制率最大，為89.73%，比優(yōu)化之前的各單酶相比，對副溶血弧菌生物膜的抑制率有顯著性提高，與預測基本相符，說明模型擬合良好，組合酶中各單酶濃度準確可行。優(yōu)化得到的組合酶有效抑制了304不銹鋼上副溶血弧菌生物膜的生長，抑制率為59.35%，掃描電鏡圖也證實了復合酶的抑制效果。生物膜降解酶復合有效提升了對生物膜的抑制率，為致病菌生物膜的降解及消除提供了新的思路。

副溶血弧菌屬于嗜鹽性的革蘭陰性菌，可以從海產(chǎn)品如魚、對蝦、蟹、貝類和海藻中分離得到，是引起食源性疾病的主要致病菌之一。副溶血弧菌污染食品后,，極易引起急性腸胃炎，使人發(fā)生惡心、嘔吐、腹瀉等癥狀，嚴重者可以引起昏迷、脫水甚至死亡。細菌生物膜是細菌黏附在非生物或生物表面，并被自身分泌的胞外多聚物如蛋白質、糖類、脂類、胞外DNA等包裹形成的一種高度組織化、系統(tǒng)化的微生物膜狀結構，是細菌在惡劣環(huán)境中為適應生存環(huán)境而形成的一種與浮游狀態(tài)相對應的存在形式。生物膜內(nèi)有細胞外基質包裹的多層細菌生長，可避免被宿主防御系統(tǒng)清除，并阻礙大部分抗菌藥物進入細菌內(nèi)。與浮游細胞相比，形成生物膜的細菌對抗菌藥物的抵抗能力會提高，形成生物膜的細菌具有高度耐藥性和能逃避免疫系統(tǒng)攻擊的特點，使其感染易慢性化并難于控制。因此，開發(fā)有效的控制和去除細菌生物膜的方法是必要的。

由于生物膜降解酶能分解細胞外基質，促進生物膜分離，因此被認為是一種新型的、環(huán)保的生物膜控制方法。由于細菌生物膜基質的多樣性，不同生物膜降解酶對細菌的作用不盡相同。研究表明，纖維素酶對玻璃表面銅綠假單胞菌生物膜的形成有部分抑制作用。α-淀粉酶可以有效的清除芽孢桿菌的生物膜，并抑制生物膜的形成。

生物膜降解酶是去除細菌生物膜的有效途徑，目前關于不同生物膜降解酶的協(xié)同增效作用缺乏了解。因此，本研究旨在探討脂肪酶、纖維素和蛋白酶K的復合優(yōu)化，并對其在304食品級不銹鋼上副溶血性弧菌生物膜的抑制作用進行初步研究。研究結果有助于控制副溶血性弧菌生物膜的形成，進一步為生物膜降解酶的應用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1菌株

副溶血弧菌VIB461由中國海洋大學應用海洋微生物實驗室提供。

1.1.2培養(yǎng)基及酶

2216E瓊脂、TSB（3%NaCl）肉湯、TSA（3%NaCl）瓊脂購自索萊寶生物科技有限公司；纖維素酶（3 U/mg）、脂肪酶（20 U/mg）、蛋白酶k（30 U/mg）購自索萊寶生物科技有限公司。

1.1.3主要儀器及試劑

PBS緩沖液、結晶紫、醋酸鈉緩沖液、96孔板、全自動高壓滅菌鍋，致微儀器有限公司；超凈工作臺，蘇州蘇潔凈化設備有限公司；振蕩培養(yǎng)箱，國華電器有限公司；酶標儀，美國Bio-Tek公司；掃描電鏡，德國ZEISS公司；實驗所用試劑均為分析純。

1.2實驗方法

1.2.1菌懸液的制備

從-80℃冰箱中取出保存的副溶血弧菌VIB461菌株在2216E瓊脂平板上活化，挑取單菌落至含3%NaCl TSB，過夜活化后，按1%的比例接種于新鮮的含3%NaCl TSB中，30℃、180 rpm/min振蕩培養(yǎng)過夜至菌液濃度為108 CFU/mL。

1.2.2復合生物酶生物膜降解酶對副溶血弧菌生物膜的抑制

將制備好的菌懸液按1%的接種量與酶以1:3的比例加入到96孔板中，同時設酶的對照組。將96孔板放置于30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

1.2.3副溶血弧菌生物膜的測定

采用結晶紫染色方法，取出孔板，棄去游離菌，用300μL無菌生理鹽水清洗3次，然后60℃干燥固定15 min，再每孔加入0.1%的結晶紫溶液300μL，染色15 min，用300μL無菌生理鹽水清洗3次，干燥后加入95%的無水乙醇300μL，放置10 min，在595 nm波長處測OD值，抑制率計算參考下式：

1.2.4單因素實驗

纖維素酶、脂肪酶、蛋白酶k濃度對副溶血弧菌生物膜形成的影響，采用二倍稀釋法將單酶進行稀釋，按1.2.2的方法加入到菌液中培養(yǎng)，設定相應的對照組，采用結晶紫染色法測定生物膜的抑制率。

1.2.5響應面優(yōu)化實驗設計

在單因素優(yōu)化試驗的基礎上以最優(yōu)纖維素酶濃度（A）、脂肪酶濃度（B）、蛋白酶k濃度（C）、自變量，根據(jù)Box-Behnken設計原理[16]，進行響應面分析試驗。以生物膜抑制率為響應值，優(yōu)化三種酶的濃度并組成最佳酶組合。因素水平設計見表1。

1.2.6 304不銹鋼上生物膜的菌落計數(shù)

菌落計數(shù)：將304不銹鋼片切割為長2 cm寬1 cm的長方形，滅菌后加入到菌液中，按1.2.2方法培養(yǎng)24 h后小心取出，將PBS清洗后的不銹鋼片放入5 mL的生理鹽水中，在20%功率的超聲波振蕩器中振蕩10 min，計算不銹鋼上生物膜活菌數(shù)。

1.2.7 304不銹鋼上生物膜的結晶紫染色

在含有TSB培養(yǎng)基和不銹鋼片試管中，將制備好的108 CFU/mL的菌懸液按1%的接種量與酶以1:3的比例加入，180 r/min培養(yǎng)24 h，取出不銹鋼片。用1.2.3的方法測定生物膜形成。

1.2.8掃描電鏡觀察304不銹鋼上的生物膜

在含有TSB培養(yǎng)基和不銹鋼片試管中，將制備好的108 CFU/mL的菌懸液按1%的接種量與酶以1:3的比例加入，180 r/min培養(yǎng)24 h，取出不銹鋼片，用PBS沖洗兩遍，加入2.5%戊二醛固定液在4℃條件下固定12 h，經(jīng)過漂洗、乙醇逐級梯度脫水、干燥、裝樣后，在掃描電鏡下觀察。

1.2.9數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)均用平均值±標準差表示，用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，進行多重比較，p<0.05表示差異顯著。

2結果與分析

2.1單因素實驗

2.1.1不同濃度纖維素酶對副溶血弧菌生物膜的抑制作用

運用不同濃度的纖維素酶研究纖維素酶濃度對副溶血弧菌生物膜的抑制作用，如圖1所示，隨著纖維素酶濃度的增加，副溶血弧菌生物膜的抑制率逐漸上升，當纖維素酶濃度為1.50 mg/mL時，生物膜抑制率達到做高為81.94%，之后趨于平緩，說明在纖維素酶濃度較低時生物膜的抑制率對纖維素酶濃度依賴性增加，但纖維素酶濃度到達1.50 mg/mL之后，抑制率沒有發(fā)生顯著性變化。Nguyen等研究發(fā)現(xiàn)，與低濃度相比，遞增濃度的DNase I不會更多抑制單增李斯特菌生物膜的形成[17]，本研究中，與低于1.50 mg/mL相比，遞增濃度的纖維素酶不會抑制更多的副溶血弧菌生物膜的形成，與之前的研究結果相符，因此選擇纖維素酶濃度的最佳點為1.50 mg/mL。

2.1.2不同濃度脂肪酶對副溶血弧菌生物膜的抑制作用

采用纖維素酶同樣的方法對脂肪酶濃度進行優(yōu)化，結果如圖2所示。隨著脂肪酶濃度的增加，生物膜的抑制率呈先上升后下降的趨勢，Lefebvre等人研究發(fā)現(xiàn)，α-淀粉酶反而增加了熒光假單胞菌的代謝活性，并且表明所選擇的酶在生物膜控制中的作用是適度的，因此，我們猜測，脂肪酶在培養(yǎng)生物膜后期會出現(xiàn)抑制率降低的情況，需進一步研究[18]。在脂肪酶濃度為1.50 mg/mL時，副溶血弧菌生物膜抑制率達到最高值60.21%，因此選擇脂肪酶濃度為1.50 mg/mL。

2.1.3不同濃度蛋白酶k對副溶血弧菌生物膜的抑制作用

蛋白質酶k對副溶血弧菌生物膜的抑制作用如圖3所示，隨著蛋白酶濃度的增加，副溶血弧菌生物膜的抑制率逐漸上升，當?shù)鞍酌?/span>k濃度為2.00μg/mL時，生物膜抑制率達到做高為58.96%，之后趨于平緩，說明在濃度較脂肪酶濃度較低時生物膜的抑制率對蛋白酶k濃度依賴性增加，但纖維素酶濃度到達2.00μg/mL之后，抑制率沒有發(fā)生顯著性變化。Nguyen等人研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶k濃度到達一定數(shù)值后，其對李斯特菌生物膜的清除率不再增加[17]。與前人對蛋白酶k的研究相比，本研究中的蛋白酶k濃度也會在一定數(shù)值后其作用不再增加，但由于作用的細菌不同，蛋白酶k的最佳濃度也不同，因此，在本研究中選擇蛋白酶k濃度的最佳點為1.50 mg/mL。

2.2響應面實驗結果

2.2.1響應面實驗設計與結果及方差分析

采用Design-Expert軟件，分別對纖維素酶、脂肪酶、蛋白酶k三個對副溶血弧菌生物膜抑制效果進行Box-Benhnken試驗設計，獲得17個試驗點，實驗數(shù)據(jù)與結果如表2所示。確定生物膜抑制率對以上因素的二次多項回歸模型為：

Y=89.11-0.53A-0.56B-0.099C+0.24AB-0.045AC+0.50BC-0.29A2-0.80B2-0.21C2由方差分析表3可知，實驗選用的模型p<0.0001，表明該模型極顯著；失擬項p=0.5568>0.05，表明失擬項不顯著，與實際實驗擬合度好；模型的校正系數(shù)RAdj=0.9498，表明該模型可以評價94.98%生物膜抑制率的變化。R=0.9780，表明實驗誤差小，該模型適合分析纖維素酶、脂肪酶、蛋白酶k三種酶對VP生物膜抑制的影響。通過F檢驗結果可知，各種酶對生物膜影響的主次順序為B>A>C，即脂肪酶對響應值的影響最大，其次是纖維素酶，最后是蛋白酶k。模型中一次項A、B對響應值的影響均為極顯著（p<0.01），模型中交互項AB、BC對相應值的影響為顯著（p<0.05），AC對相應值的影響為不顯著（p>0.05）。

2.2.2響應面分析

通過纖維素酶與脂肪酶（AB）、纖維素酶與蛋白酶k（AC）、脂肪酶與蛋白酶k（BC）的響應面圖可以看出（圖4所示），脂肪酶與蛋白酶k（BC）響應面彎曲程度最大，表明兩者交互作用最明顯，脂肪酶和蛋白酶k對生物膜的抑制作用可以相互促進；纖維素酶與脂肪酶（AB）響應面彎曲程度次之，表明兩者交互作用次之；最后是纖維素酶與蛋白酶k（AC），兩者響應面較平坦，交互作用不明顯。這與方差分析結果相吻合。

2.2.3最佳復合酶驗證

利用Design-Expert軟件進行響應參數(shù)的優(yōu)化，通過響應曲面分析，確定獲得生物膜抑制率最大值的條件為：纖維素酶濃度為1.00 mg/mL，脂肪酶濃度為1.10 mg/mL，蛋白酶k濃度為1.50 mg/mL，此時生物膜抑制率最大為89.73%，根據(jù)優(yōu)化條件得到的抑制率為89.65%，與預測基本相符，無顯著性差異。

在細菌細胞中，超過90%的生物膜基質以三維空間結構存在，因此，通過降解生物膜基質是去除生物膜的有效方法，酶作為一種綠色高效的生物膜抑制劑已被廣泛應用于金黃色葡萄球菌、熒光假單胞菌、李斯特氏菌。如采用β-葡聚糖酶處理可顯著抑制熒光假單胞菌生物膜的形成[20]，采用Benzonase處理可使金黃色葡萄球菌生物膜抑制率達79.80%。由于生物膜基質包含蛋白質、DNA和多糖等多種組分，單一酶降解生物膜有其局限性。蛋白酶k只降解蛋白質類物質、纖維素酶只降解多糖類物質、脂肪酶只降解脂類物質，本研究在前人研究的基礎上采用生物膜降解酶復合，利用纖維素酶、蛋白酶k、脂肪酶的交互作用，打破單一酶降解的局限性，顯著提升了副溶血弧菌生物膜的降解率，為副溶血弧菌的有效控制提供了理論基礎。

2.3組合酶對304不銹鋼上生物膜的抑制作用

2.3.1結晶紫染色與菌落計數(shù)

由于副溶血弧菌常常存留在某些食品接觸面上，如聚苯乙烯、食品級不銹鋼等，因此，復合酶優(yōu)化的過程是以聚苯乙烯為載體，為了研究復合酶對副溶血弧菌生物膜在不同載體上的抑制效果，我們增加了以不銹鋼為載體的研究，結果如圖5所示，通過結晶紫染色和菌落計數(shù)可以看出，復合酶處理使304不銹鋼上副溶血弧菌的生物膜上的細菌數(shù)量顯著降低，使生物膜的厚度顯著降低。

有研究表明，生物膜的形成與生物膜內(nèi)的嵌入細菌之間存在顯著的相關性，林鐲等人發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌生物膜內(nèi)的細菌數(shù)量隨著Benzonase酶濃度的升高而降低，而其生物膜的厚度也隨之降低[21]。Melvin等人發(fā)現(xiàn)0.70 mm香芹酚可以減少2.0 lg(CFU/mL)的沙門氏菌在不銹鋼表面的附著，因此得出香芹酚導致細菌附著減少從而形成較弱的生物膜[22]。Harmsen等人發(fā)現(xiàn)蛋白酶K對玻璃片上李斯特菌附著的生物膜沒有顯著作用，而Nguyen等人發(fā)現(xiàn)蛋白酶k可以顯著降低李斯特菌在不銹鋼上的附著[17]。前人的研究表明了抑制細菌在不銹鋼上的附著可以抑制細菌在不銹鋼上生物膜的形成，在本實驗中，復合酶同樣可以減少2.3 lg(CFU/mL)的副溶血弧菌在不銹鋼表面的附著，可以顯著的抑制304不銹鋼上副溶血弧菌的生物膜形成。但由于細菌種類不同，與前人研究結果相比，不同的酶作用效果也不一樣，而復合酶除降解生物膜基質之外是否還通過其他作用抑制生物膜的形成，這還需進一步研究。

2.3.2掃描電鏡觀察

通過掃描電鏡，我們可以清楚的看到細菌粘附在不銹鋼上的狀態(tài)及復合酶的抑制效果。如圖6所示，對照組細菌可以大量黏附在不銹鋼上，并形成局部的生物膜(6a)，經(jīng)過復合酶的處理后，只有個別細菌粘附在不銹鋼板上，沒有形成生物膜(6b)。Cai等人通過掃描電鏡可以清晰的發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過酸性電解水處理的熒光假單胞菌生物膜被分離，被分解成小的胞外基質聚集體，胞外基質和細菌黏附數(shù)量相比于未處理組顯著減少，酸性電解水可以有效的抑制熒光假單胞菌生物膜的形成。Lekbach等人通過掃描電鏡可以觀察到經(jīng)過丹參提取物處理的在不銹鋼上的銅綠假單胞菌生物膜由原來的緊密網(wǎng)狀結構變?yōu)橄∷傻男【奂�體，并且菌體形態(tài)發(fā)生變化，內(nèi)溶物外滲，由此發(fā)現(xiàn)丹參提取物可能通過作用于細菌的細胞膜從而抑制銅綠假單胞菌在不銹鋼生物膜上的形成[25]。Nguyen等人通過掃描電鏡圖發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，200μg/mL蛋白酶k能完全去除李斯特菌在不銹鋼上的生物膜，在本實驗中，從圖6可以看出含有蛋白酶k的復合酶雖然能有效降低不銹鋼上副溶血弧菌的黏附及胞外聚集體的形成，但卻不能完全清除生物膜，這可能是由于不同細菌生物膜胞外基質的種類不同，各類基質的含量也不同造成的，這說明，在副溶血弧菌生物膜基質中蛋白質的含量要比李斯特菌含量少，先前已有研究發(fā)現(xiàn)DNA酶I抑制和分散金黃色葡萄球菌生物膜，但對表皮葡萄球菌生物膜無效。因此，本實驗優(yōu)化得到的復合酶是可以有效降低副溶血弧菌在食品加工器皿上的附著滋生，進一步提升食品安全性。

3結論

本研究通過響應面優(yōu)化確定纖維素酶、脂肪酶和蛋白酶濃度復合其濃度分別為1.0 mg/mL、1.1 mg/mL、1.5 mg/mL，在該條件下，復合膜對副溶血弧菌生物膜抑制率可達89.73%，但載體不同，復合酶的抑制效果不同，其掃描電鏡結果進一步證實了抑制效果，這為以生物膜基質為靶點的致病菌控制策略提供了理論依據(jù)。